NGS (секвенирование нового поколения) — современная молекулярная диагностика в CSD

За последние годы значительно возросло количество новых разработок в сфере персонализированной диагностики и медицины. И если на начало XXI века секвенирование ДНК считалось технологии будущего, слишком сложной и дорогой для повседневного использования в диагностике, сегодня секвенирование нового поколения (NGS) позволяет быстро и эффективно узнать последовательность нуклеотидов в регионе интереса.

На 2020 год в Украине было зафиксировано 162 594 новых случаев онкологических заболеваний и 84 194 смерти от онкологии. По данным Всемирной организации здравоохранения (World Health Organisation), в 2020 году в Украине самые распространенные новые случаи онкологии относятся к колоректальному раку, раку молочной железы и раку легких (оба пола, независимо от возраста), а среди женщин, в том числе по мировой статистике, рак молочной железы занимает первое место среди новых онкологических заболеваний.

Рис. 1. Статистика по типам онкологических заболеваний в Украине за 2020 год. World Health Organization, Globocan [1].

Риск возникновения рака молочной железы, а также рака яичников и простаты может быть детерминированным как генетическими мутациями, которые возникли в течение жизни человека, так и наследственными мутациями, которые передаются из поколения в поколение (~10%) [2]. Идентификация мутаций, которые являются биологическими маркерами этих онкологических процессов, позволяет выявить принадлежность человека к группам риска развития соответствующих заболеваний.

Среди ключевых генетических факторов развития рака молочной железы и яичников, важная роль принадлежит мутациям в генах BRCA1 и BRCA2 (далее BRCA1/2). Гены BRCA1/2 кодируют белки, которые помогают восстанавливать поврежденную ДНК. У каждого человека есть две копии каждого из этих генов, унаследованные по одной копии от каждого из родителей. BRCA1 и BRCA2 называют генами супрессорами опухоли, поскольку повреждения генетического кода этих последовательностей может влиять на функционал соответствующих белков, вследствие чего может развиться рак. Наследование патогенных вариантов этих генов увеличивает риск возникновения нескольких видов рака, в частности, рака молочной железы и яичников, простаты, рака поджелудочной и др. Патогенные герминативные мутации BRCA1/2 являются причиной около 10% случаев рака молочной железы и яичников. Среди женщин-носителей мутаций в генах BRCA1/2, риск развития рака молочной железы в течение жизни составляет ~72% с мутацией в BRCA1 и ~ 69% — в BRCA2. По поводу рака яичников, риск развития заболевания до 80 лет составляет ~44% с мутацией в BRCA1, и ~17% —  в BRCA2 [3]. В опухолях патогенные соматические мутации BRCA1/2 приводят к нарушению систем репарации ДНК, что может влиять на клональную дифференциацию и определять целесообразность терапевтического вмешательства.

Гены BRCA1 и BRCA2 являются важными клиническими биомаркерами, определяющими как принадлежность человека к группам риска развития онкологии, так и классификацию существующей опухоли, возможные показатели резистентности к терапии и четкую картину генетических изменений.

Тестирование на определение мутаций BRCA1/2 (BRCA1 и BRCA2) проводится по методикам ПЦР (обычно ПЦР в режиме реального времени) и секвенирования нового поколения (NGS). В то время как ПЦР исследования позволяют анализировать четко определенные мутации в небольшом количестве хорошо исследованных регионов этих генов, NGS панели позволяют анализировать всю последовательность гена и идентифицировать как хорошо известные генетические изменения, так и новые неисследованные мутации. Благодаря новейшим технологиям Illumina ®  генетические последовательности считываются десятки тысяч раз, что обеспечивает плотное покрытие и радикально уменьшает вероятность ложной интерпретации результатов.

Рис. 2. Распространение патогенных вариантов BRCA1/2 в Европе и США, Азии и Китае. Варианты распространены в различных регионах обозначены цветами: синий — Европа и США, зеленый — Азия, красный — Китай. Одна точка отражает один вариант, а длина столбца характеризует частоту возникновения мутации в соответствующей группе. a — BRCA1; b — BRCA2 [5].

Анализ вариантов на основе метода NGS является самой современной на сегодняшний день практикой исследования важных генетических изменений. По сравнению с ПЦР анализом, методика NGS фактически устраняет вероятность ненахождения важных преобразований в пределах детекции реакции.

На практике анализ последовательности генов семейства BRCA проводится по двум типам материала: операционный материал после удаления опухоли и периферическая кровь. По результатам генетического анализа опухолевого материала определяются как герминативные, так и соматические мутации. Результаты исследования позволяют сделать выводы о важных перестройках генетического профиля опухоли, помогает в персонализированном выборе противоопухолевой терапии. А при анализе периферической крови можно определить наследственные мутации BRCA1/2 и, соответственно, принадлежность человека, а также подозрение на принадлежность ее родственников к группе риска по развитию наследственных раков.

В пределах спектра услуг Медицинской лаборатории CSD в области молекулярной диагностики для исследования мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 используются преимущественно методики на основе NGS секвенирования. Скрининг последовательностей BRCA1/2 доступен не только в виде отдельного исследования, но и в комплексе с анализом других генов. Такие NGS панели обычно направлены на определенную модель пациента, и, в отличие от исследования генетических изменений непосредственно в опухолях, могут быть направлены на определение наследственной предрасположенности к развитию онкологических заболеваний (М028, 30 генов).

Денис Козаков,
Молекулярный биолог,
сотрудник отдела молекулярной патологии и генетики,
CSD Medical Laboratory, Ukraine

Источники:

1. Globocan 2020 © International Agency for Research on Cancer 2021.
2. Rizzolo P, Silvestri V, Falchetti M, Ottini L. Inherited and acquired alterations in development of breast cancer. Appl Clin Genet. 2011 Nov 14;4:145-58. doi: 10.2147/TACG.S13226.
3. Kuchenbaecker KB, Hopper JL, Barnes DR, et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. JAMA. 2017; 317(23):2402–2416. doi:10.1001/jama.2017.7112.
4. Lee J-m, Ledermann JA & Kohn ЕС. PARP Inhibitors for BRCA1/2 mutation-associated and BRCA-like malignancies. Annals of Oncology 2014, 25: 32–40. doi:10.1093/annonc/mdt384.
5. Liu, Y., Wang, H., Wang, X. et al. Prevalence and reclassification of BRCA1 and BRCA2 variants in a large, unselected Chinese Han breast cancer cohort. J Hematol Oncol 14, 18 (2021). https://doi.org/10.1186/s13045-020-01010-0.